Javascript បច្ចុប្បន្នត្រូវបានបិទនៅក្នុងកម្មវិធីរុករករបស់អ្នក។នៅពេលដែល javascript ត្រូវបានបិទ មុខងារមួយចំនួននៃគេហទំព័រនេះនឹងមិនដំណើរការទេ។
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * អ្នកនិពន្ធទាំងនេះមានការយល់ដឹងខ្លះៗអំពីការងារនេះស្មើគ្នា។ ផ្ទៃខាងក្រោយនៃការរួមចំណែក៖ អាស៊ីត Hyaluronic (HA) គឺជាសារធាតុប៉ូលីស្យូសដែលកើតឡើងដោយធម្មជាតិដែលត្រូវបានប្រើក្នុងការផលិតសារធាតុបំពេញស្បែកសម្រាប់គោលបំណងសាភ័ណភ្ព។ដោយសារវាមានអាយុកាលពាក់កណ្តាលនៃរយៈពេលជាច្រើនថ្ងៃនៅក្នុងជាលិការបស់មនុស្ស សារធាតុបំពេញស្បែកដែលមានមូលដ្ឋានលើ HA ត្រូវបានកែប្រែដោយគីមីដើម្បីពន្យារអាយុជីវិតរបស់ពួកគេនៅក្នុងរាងកាយ។ការកែប្រែទូទៅបំផុតនៅក្នុងឧបករណ៍បំពេញដែលមានមូលដ្ឋានលើ HA ពាណិជ្ជកម្មគឺការប្រើប្រាស់ 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) ជាភ្នាក់ងារភ្ជាប់ដើម្បីភ្ជាប់ខ្សែសង្វាក់ HA ។BDDE ដែលនៅសេសសល់ឬមិនមានប្រតិកម្មត្រូវបានចាត់ទុកថាមិនមានជាតិពុលនៅ <2 ផ្នែកក្នុងមួយលាន (ppm);ដូច្នេះ BDDE ដែលនៅសេសសល់ក្នុងឧបករណ៍បំពេញស្បែកចុងក្រោយត្រូវតែមានបរិមាណ ដើម្បីធានាសុវត្ថិភាពអ្នកជំងឺ។សម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត៖ ការសិក្សានេះពិពណ៌នាអំពីការរកឃើញ និងលក្ខណៈនៃអនុផលនៃប្រតិកម្មតំណឆ្លងរវាង BDDE និង HA ក្រោមលក្ខខណ្ឌអាល់កាឡាំង ដោយការរួមបញ្ចូលគ្នារវាងក្រូម៉ាតូក្រាមរាវ និងម៉ាស់ (LC-MS)។លទ្ធផល៖ បន្ទាប់ពីការវិភាគផ្សេងៗគ្នា វាត្រូវបានគេរកឃើញថាលក្ខខណ្ឌអាល់កាឡាំង និងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ដែលប្រើដើម្បីសម្លាប់មេរោគ HA-BDDE អ៊ីដ្រូហ្គេលបានលើកកម្ពស់ការបង្កើតផលិតផលថ្មីនេះ ដែលជាសមាសធាតុ "propylene glycol-like" ។ការវិភាគ LC-MS បានបញ្ជាក់ថា អនុផលមានម៉ាស់ monoisotopic ដូច BDDE ពេលវេលារក្សាទុកខុសគ្នា (tR) និងរបៀបស្រូបកាំរស្មី UV ផ្សេងគ្នា (λ=200 nm) ។មិនដូច BDDE ទេ វាត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងការវិភាគ LC-MS ដែលនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃការវាស់វែងដូចគ្នា អនុផលនេះមានអត្រារកឃើញខ្ពស់ជាងនៅ 200 nm ។សេចក្តីសន្និដ្ឋាន៖ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាមិនមានសារធាតុ epoxide នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធនៃសមាសធាតុថ្មីនេះទេ។ការពិភាក្សាគឺបើកចំហដើម្បីវាយតម្លៃហានិភ័យនៃផលផ្លែថ្មីនេះដែលបានរកឃើញនៅក្នុងការផលិត HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) សម្រាប់គោលបំណងពាណិជ្ជកម្ម។ពាក្យគន្លឹះ៖ អាស៊ីត hyaluronic, HA dermal filler, cross-linked hyaluronic acid, BDDE, LC-MS analysis, BDDE by-product.
Fillers ដែលមានមូលដ្ឋានលើអាស៊ីត hyaluronic (HA) គឺជាថ្នាំបំប៉នស្បែកទូទៅ និងពេញនិយមបំផុតដែលប្រើសម្រាប់គោលបំណងគ្រឿងសំអាង។1 សារធាតុបំពេញស្បែកនេះគឺជាអ៊ីដ្រូជែល ដែលជាធម្មតាមានសមាសភាពនៃទឹក > 95% និង 0.5-3% HA ដែលផ្តល់ឱ្យពួកគេនូវរចនាសម្ព័ន្ធដូចជែល។2 HA គឺជាសារធាតុ polysaccharide និងជាសមាសធាតុសំខាន់នៃម៉ាទ្រីស extracellular នៃ vertebrates ។មួយនៃគ្រឿងផ្សំ។វាមាន (1,4)-អាស៊ីត glucuronic-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) ឯកតា disaccharide ដែលតភ្ជាប់ដោយចំណង glycosidic ។គំរូ disaccharide នេះគឺដូចគ្នានៅក្នុងសារពាង្គកាយទាំងអស់។បើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងសារធាតុបំពេញដែលមានមូលដ្ឋានលើប្រូតេអ៊ីនមួយចំនួន (ដូចជាកូឡាជែន) ទ្រព្យសម្បត្តិនេះធ្វើឱ្យ HA ក្លាយជាម៉ូលេគុលជីវសាស្រ្តខ្ពស់។សារធាតុបំពេញទាំងនេះអាចបង្ហាញពីភាពជាក់លាក់នៃលំដាប់អាស៊ីតអាមីណូ ដែលអាចត្រូវបានទទួលស្គាល់ដោយប្រព័ន្ធការពាររបស់អ្នកជំងឺ។
នៅពេលប្រើជាសារធាតុបំពេញស្បែក ការកំណត់សំខាន់នៃ HA គឺការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងឆាប់រហ័សរបស់វានៅក្នុងជាលិកាដោយសារតែវត្តមានរបស់ក្រុមគ្រួសារជាក់លាក់នៃអង់ស៊ីមដែលហៅថា hyaluronidases ។រហូតមកដល់ពេលនេះ ការកែប្រែគីមីជាច្រើននៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ HA ត្រូវបានពិពណ៌នាដើម្បីបង្កើនពាក់កណ្តាលជីវិតនៃ HA នៅក្នុងជាលិកា។3 ភាគច្រើននៃការកែប្រែទាំងនេះព្យាយាមកាត់បន្ថយការចូលប្រើរបស់ hyaluronidase ទៅកាន់ប៉ូលីម័រប៉ូលីមៀដោយខ្សែសង្វាក់ HA ដែលភ្ជាប់គ្នា។ដូច្នេះ ដោយសារការបង្កើតស្ពាន និងចំណងអន្តរម៉ូលេគុល covalent រវាងរចនាសម្ព័ន្ធ HA និងភ្នាក់ងារតភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ HA hydrogel ដែលភ្ជាប់គ្នានឹងផលិតផលិតផលប្រឆាំងនឹងការរិចរិលអង់ស៊ីមច្រើនជាង HA ធម្មជាតិ។៤-៦
រហូតមកដល់ពេលនេះ ភ្នាក់ងារចម្លងគីមីដែលប្រើសម្រាប់ផលិត crosslinked HA រួមមាន methacrylamide, 7 hydrazide, 8 carbodiimide, 9 divinyl sulfone, 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) និង poly (ethylene glycol) diglycidyl ether ។10 ,11 BDDE បច្ចុប្បន្នគឺជាភ្នាក់ងារឆ្លងកាត់ដែលប្រើជាទូទៅបំផុត។ទោះបីជាប្រភេទអ៊ីដ្រូហ្គេលទាំងនេះត្រូវបានបញ្ជាក់ថាមានសុវត្ថិភាពអស់ជាច្រើនទសវត្សរ៍ក៏ដោយ ភ្នាក់ងារចម្លងដែលប្រើគឺជាសារធាតុប្រតិកម្មដែលអាចជាសារធាតុស៊ីតូតូកុលិក ហើយក្នុងករណីខ្លះ សារធាតុ mutagenic ។12 ដូច្នេះហើយ មាតិកាសំណល់របស់ពួកគេនៅក្នុងអ៊ីដ្រូជែលចុងក្រោយត្រូវតែខ្ពស់។BDDE ត្រូវបានគេចាត់ទុកថាមានសុវត្ថិភាពនៅពេលដែលកំហាប់សំណល់គឺតិចជាង 2 ផ្នែកក្នុងមួយលាន (ppm) ។៤
មានវិធីសាស្រ្តជាច្រើនដើម្បីរកឱ្យឃើញកំហាប់ BDDE សំណល់ទាប កម្រិតតំណឆ្លង និងទីតាំងជំនួសនៅក្នុង HA hydrogels ដូចជា chromatography ឧស្ម័ន ការដកទំហំ chromatography គួបផ្សំជាមួយ mass spectrometry (MS) វិធីសាស្ត្រវាស់ស្ទង់ fluorescence resonance ម៉ាញេទិកនុយក្លេអ៊ែរ (NMR) និង អារេ diode ភ្ជាប់ជាមួយ chromatography រាវដែលដំណើរការខ្ពស់ (HPLC) ។13-17 ការសិក្សានេះពិពណ៌នាអំពីការរកឃើញ និងលក្ខណៈនៃអនុផលនៅក្នុង HA hydrogel ដែលភ្ជាប់គ្នាចុងក្រោយដែលផលិតដោយប្រតិកម្មនៃ BDDE និង HA ក្រោមលក្ខខណ្ឌអាល់កាឡាំង។HPLC និង Liquid chromatography-mass spectrometry (ការវិភាគ LC-MS) ។ដោយសារការពុលនៃផលិតផល BDDE នេះមិនស្គាល់ យើងសូមណែនាំថា បរិមាណសំណល់របស់វាគួរតែត្រូវបានកំណត់ក្នុងលក្ខណៈស្រដៀងគ្នាទៅនឹងវិធីសាស្ត្រដែលជាធម្មតាត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ BDDE នៅក្នុងផលិតផលចុងក្រោយ។
អំបិលសូដ្យូមដែលទទួលបានពី HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) មានទម្ងន់ម៉ូលេគុល ~ 1,368,000 Da (វិធីសាស្ត្រ Laurent) 18 និង viscosity ខាងក្នុង 2.20 m3/kg ។សម្រាប់ប្រតិកម្មឆ្លង BDDE (≥95%) ត្រូវបានទិញពី Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)។Phosphate buffered saline ជាមួយ pH 7.4 ត្រូវបានទិញពីក្រុមហ៊ុន Sigma-Aldrich ។សារធាតុរំលាយទាំងអស់ acetonitrile និងទឹកដែលប្រើក្នុងការវិភាគ LC-MS ត្រូវបានទិញពីគុណភាពថ្នាក់ទី HPLC ។អាស៊ីត Formic (98%) ត្រូវបានទិញជា reagent grade ។
ការពិសោធន៍ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើប្រព័ន្ធ UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) និងបានភ្ជាប់ទៅឧបករណ៍វាស់ស្ទង់កម្រិត API 3000 triple quadrupole mass spectrometer ដែលបំពាក់ដោយប្រភពអ៊ីយ៉ូដ electrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, USA)។
ការសំយោគ HA hydrogels ឆ្លងត្រូវបានចាប់ផ្តើមដោយបន្ថែម 198 mg នៃ BDDE ទៅក្នុងដំណោះស្រាយ 10% (w/w) sodium hyaluronate (NaHA) ក្នុងវត្តមាន 1% alkali (sodium hydroxide, NaOH) ។ការប្រមូលផ្តុំ BDDE ចុងក្រោយនៅក្នុងល្បាយប្រតិកម្មគឺ 9.9 mg/mL (0.049 mM) ។បន្ទាប់មក ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ និងធ្វើឱ្យដូចគ្នា ហើយត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យដំណើរការនៅសីតុណ្ហភាព 45°C រយៈពេល 4 ម៉ោង។19 pH នៃប្រតិកម្មត្រូវបានរក្សានៅ ~12 ។
បន្ទាប់មក ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានលាងសម្អាតដោយទឹក ហើយអ៊ីដ្រូជែល HA-BDDE ចុងក្រោយត្រូវបានត្រង និងពនឺជាមួយសតិបណ្ដោះអាសន្ន PBS ដើម្បីទទួលបានកំហាប់ HA ពី 10 ទៅ 25 mg/mL និង pH ចុងក្រោយនៃ 7.4 ។ដើម្បីក្រៀវអ៊ីដ្រូហ្គេល HA ដែលភ្ជាប់គ្នាបានផលិតរួច អ៊ីដ្រូហ្គេលទាំងអស់នេះត្រូវបានធ្វើដោយស្វ័យប្រវត្ត (120°C រយៈពេល 20 នាទី)។អ៊ីដ្រូជែល BDDE-HA ដែលបន្សុតត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 4 ° C រហូតដល់ការវិភាគ។
ដើម្បីវិភាគ BDDE ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងផលិតផល HA ដែលភ្ជាប់គ្នានោះ សំណាក 240 mg ត្រូវបានថ្លឹង និងបញ្ចូលទៅក្នុងរន្ធកណ្តាល (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; បរិមាណ 0.5 mL) និង centrifuged នៅ 10,000 rpm នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ 10 នាទី។សរុប 20 µL នៃអង្គធាតុរាវទាញចុះក្រោមត្រូវបានប្រមូល និងវិភាគ។
ដើម្បីវិភាគស្តង់ដារ BDDE (Sigma-Aldrich Co) ក្រោមលក្ខខណ្ឌអាល់កាឡាំង (1%, 0.1% និង 0.01% NaOH) ប្រសិនបើលក្ខខណ្ឌខាងក្រោមត្រូវបានបំពេញ គំរូរាវគឺ 1:10, 1:100 ឬរហូតដល់ 1:1,000,000 បើចាំបាច់ សូមប្រើទឹក MilliQ deionized សម្រាប់ការវិភាគ។
សម្រាប់សមា្ភារៈចាប់ផ្តើមដែលប្រើក្នុងប្រតិកម្មតំណឆ្លង (HA 2%, H2O, 1% NaOH, និង 0.049 mM BDDE) 1 mL នៃគំរូនីមួយៗដែលបានរៀបចំពីវត្ថុធាតុទាំងនេះត្រូវបានវិភាគដោយប្រើលក្ខខណ្ឌនៃការវិភាគដូចគ្នា។
ដើម្បីកំណត់ភាពជាក់លាក់នៃកំពូលដែលលេចឡើងក្នុងផែនទីអ៊ីយ៉ុង ដំណោះស្រាយស្តង់ដារ 10 µL នៃ 100 ppb BDDE (Sigma-Aldrich Co) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងគំរូ 20 µL ។ក្នុងករណីនេះការប្រមូលផ្តុំចុងក្រោយនៃស្តង់ដារនៅក្នុងគំរូនីមួយៗគឺ 37 ppb ។
ជាដំបូង រៀបចំដំណោះស្រាយស្តុក BDDE ជាមួយនឹងកំហាប់ 11,000 mg/L (11,000 ppm) ដោយរំលាយ 10 μL នៃ BDDE ស្តង់ដារ (Sigma-Aldrich Co) ជាមួយនឹងទឹក 990 μL MilliQ (ដង់ស៊ីតេ 1.1 g/mL)។ប្រើដំណោះស្រាយនេះដើម្បីរៀបចំដំណោះស្រាយ BDDE 110 µg/L (110 ppb) ជាដំណោះស្រាយស្តង់ដារកម្រិតមធ្យម។បន្ទាប់មកប្រើ BDDE standard diluent កម្រិតមធ្យម (110 ppb) ដើម្បីរៀបចំខ្សែកោងស្តង់ដារដោយ diluting កម្រិតមធ្យម diluent ជាច្រើនដងដើម្បីសម្រេចបាននូវកំហាប់ដែលចង់បានគឺ 75, 50, 25, 10, និង 1 ppb ។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 1 វាត្រូវបានគេរកឃើញថាខ្សែកោងស្តង់ដារ BDDE ពី 1.1 ដល់ 110 ppb មានលីនេអ៊ែរល្អ (R2> 0.99) ។ខ្សែកោងស្តង់ដារត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតនៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបួន។
រូបភាពទី 1 ខ្សែកោងការក្រិតតាមខ្នាតស្តង់ដារ BDDE ដែលទទួលបានដោយការវិភាគ LC-MS ដែលក្នុងនោះទំនាក់ទំនងល្អត្រូវបានអង្កេត (R2> 0.99) ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ក្រូម៉ាតូក្រាមរាវ និងវិសាលគមម៉ាស។
ដើម្បីកំណត់ និងកំណត់បរិមាណស្តង់ដារ BDDE ដែលមានវត្តមាននៅក្នុង HA ឆ្លងភ្ជាប់ និងស្តង់ដារ BDDE នៅក្នុងដំណោះស្រាយមូលដ្ឋាន ការវិភាគ LC-MS ត្រូវបានប្រើប្រាស់។
ការបំបែកក្រូម៉ូសូមត្រូវបានសម្រេចនៅលើជួរឈរ LUNA 2.5 µm C18(2)-HST (50 × 2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) និងរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (25°C) កំឡុងពេលវិភាគ។ដំណាក់កាលចល័តមាន acetonitrile (សារធាតុរំលាយ A) និងទឹក (សារធាតុរំលាយ B) ដែលមានអាស៊ីត formic 0.1% ។ដំណាក់កាលចល័តត្រូវបាន elution ដោយ gradient elution ។ជម្រាលមានដូចខាងក្រោម: 0 នាទី 2% A;1 នាទី 2% A;6 នាទី 98% A;7 នាទី 98% A;7.1 នាទី, 2% A;10 នាទី , 2% A. រយៈពេលដំណើរការគឺ 10 នាទី ហើយបរិមាណចាក់គឺ 20 µL។ពេលវេលារក្សាទុកនៃ BDDE គឺប្រហែល 3.48 នាទី (ចាប់ពី 3.43 ទៅ 4.14 នាទីដោយផ្អែកលើការពិសោធន៍) ។ដំណាក់កាលចល័តត្រូវបានបូមក្នុងអត្រាលំហូរ 0.25 mL/min សម្រាប់ការវិភាគ LC-MS ។
សម្រាប់ការវិភាគ BDDE និងបរិមាណដោយ MS ប្រព័ន្ធ UPLC (Waters) ត្រូវបានផ្សំជាមួយ API 3000 triple quadrupole mass spectrometer (AB SCIEX) ដែលបំពាក់ដោយប្រភពអ៊ីយ៉ូដ electrospray ហើយការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តក្នុងរបៀបអ៊ីយ៉ុងវិជ្ជមាន (ESI+)។
យោងតាមការវិភាគបំណែកអ៊ីយ៉ុងដែលបានអនុវត្តនៅលើ BDDE បំណែកដែលមានអាំងតង់ស៊ីតេខ្ពស់បំផុតត្រូវបានកំណត់ថាជាបំណែកដែលត្រូវគ្នានឹង 129.1 Da (រូបភាព 6) ។ដូច្នេះនៅក្នុងរបៀបត្រួតពិនិត្យពហុអ៊ីយ៉ុង (MIM) សម្រាប់បរិមាណ ការបំប្លែងម៉ាស់ (សមាមាត្រម៉ាស់ទៅបន្ទុក [m/z]) នៃ BDDE គឺ 203.3/129.1 ដា។វាក៏ប្រើរបៀបស្កេនពេញលេញ (FS) និងរបៀបស្កេនអ៊ីយ៉ុងផលិតផល (PIS) សម្រាប់ការវិភាគ LC-MS ។
ដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពជាក់លាក់នៃវិធីសាស្ត្រ គំរូទទេមួយ (ដំណាក់កាលដំបូងចល័ត) ត្រូវបានវិភាគ។គ្មានសញ្ញាណាមួយត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងគំរូទទេជាមួយនឹងការបំប្លែងដ៏ធំនៃ 203.3/129.1 Da ។ទាក់ទងនឹងការធ្វើឡើងវិញនៃការពិសោធន៍ ការចាក់ស្តង់ដារចំនួន 10 នៃ 55 ppb (នៅពាក់កណ្តាលខ្សែកោងក្រិត) ត្រូវបានវិភាគ ដែលបណ្តាលឱ្យមានគម្លាតស្តង់ដារសំណល់ (RSD) <5% (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) ។
មាតិកា BDDE ដែលនៅសេសសល់ត្រូវបានគេកំណត់បរិមាណនៅក្នុង BDDE អ៊ីដ្រូហ្គេល HA ដែលភ្ជាប់ដោយស្វ័យប្រវត្តចំនួនប្រាំបីផ្សេងគ្នា ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបួន។ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងផ្នែក "សម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត" បរិមាណត្រូវបានវាយតម្លៃដោយតម្លៃមធ្យមនៃខ្សែកោងតំរែតំរង់នៃការរំលាយស្តង់ដារ BDDE ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងកំពូលតែមួយគត់ដែលបានរកឃើញនៅការផ្លាស់ប្តូរម៉ាស់ BDDE នៃ 203.3/129.1 Da ជាមួយនឹងការរក្សាទុក ពេលវេលាពី 3.43 ទៅ 4.14 នាទីមិនរង់ចាំ។រូបភាពទី 2 បង្ហាញឧទាហរណ៍ chromatogram នៃស្តង់ដារយោង BDDE 10 ppb ។តារាងទី 1 សង្ខេបមាតិកា BDDE ដែលនៅសល់នៃអ៊ីដ្រូជែលចំនួនប្រាំបីផ្សេងគ្នា។ជួរតម្លៃគឺ 1 ដល់ 2.46 ppb ។ដូច្នេះកំហាប់ BDDE សំណល់នៅក្នុងគំរូគឺអាចទទួលយកបានសម្រាប់ការប្រើប្រាស់របស់មនុស្ស (<2 ppm) ។
រូបភាពទី 2 Ion chromatogram នៃ 10 ppb ស្តង់ដារយោង BDDE (Sigma-Aldrich Co), ការផ្លាស់ប្តូរ MS (m/z) ដែលទទួលបានដោយការវិភាគ LC-MS នៃ 203.30/129.10 Da (ក្នុងរបៀប MRM វិជ្ជមាន)។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន;MS, ម៉ាស;m/z សមាមាត្រម៉ាស់ទៅបន្ទុក។
ចំណាំ៖ គំរូ 1-8 គឺជា BDDE cross-linked HA hydrogels ស្វ័យប្រវត្តិ។បរិមាណសំណល់នៃ BDDE នៅក្នុងអ៊ីដ្រូជែល និងកម្រិតកំពូលនៃពេលវេលារក្សា BDDE ក៏ត្រូវបានរាយការណ៍ផងដែរ។ទីបំផុតអត្ថិភាពនៃកំពូលភ្នំថ្មីដែលមានរយៈពេលរក្សាទុកខុសៗគ្នាក៏ត្រូវបានរាយការណ៍ផងដែរ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, អាស៊ីត hyaluronic;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន;tR, ពេលវេលារក្សាទុក;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;RRT, ពេលវេលារក្សាទុកដែលទាក់ទង។
គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល ការវិភាគនៃក្រូម៉ាតូក្រាម LC-MS អ៊ីយ៉ុង បានបង្ហាញថា ដោយផ្អែកលើសំណាក HA hydrogel ឆ្លងកាត់ autoclaved ទាំងអស់ដែលបានវិភាគ វាមានកម្រិតខ្ពស់បន្ថែមទៀតនៅរយៈពេលរក្សាទុកខ្លីជាងពី 2.73 ទៅ 3.29 នាទី។ឧទាហរណ៍ រូបភាពទី 3 បង្ហាញអ៊ីយ៉ុងក្រូម៉ាតូក្រាមនៃគំរូ HA ឆ្លងដែលភ្ជាប់គ្នា ដែលកំពូលបន្ថែមលេចឡើងនៅពេលវេលារក្សាទុកខុសគ្នាប្រហែល 2.71 នាទី។ពេលវេលារក្សាទំនាក់ទំនងដែលបានសង្កេត (RRT) រវាងកំពូលដែលបានសង្កេតថ្មី និងកំពូលពី BDDE ត្រូវបានរកឃើញថាជា 0.79 (តារាងទី 1)។ដោយសារយើងដឹងថាកំពូលភ្នំដែលបានសង្កេតថ្មីគឺមិនសូវត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងជួរឈរ C18 ដែលប្រើក្នុងការវិភាគ LC-MS នោះកំពូលថ្មីអាចត្រូវគ្នាទៅនឹងសមាសធាតុប៉ូលជាង BDDE ។
រូបភាពទី 3 chromatogram អ៊ីយ៉ុងនៃសំណាក HA hydrogel ឆ្លងកាត់តំណភ្ជាប់ដែលទទួលបានដោយ LC-MS (ការបំប្លែងម៉ាស់ MRM 203.3/129.0 Da) ។
អក្សរកាត់: HA, អាស៊ីត hyaluronic;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន;RRT, ពេលវេលារក្សាទុកដែលទាក់ទង;tR, ពេលវេលារក្សាទុក។
ដើម្បីច្រានចោលនូវលទ្ធភាពដែលថាកំពូលថ្មីដែលគេសង្កេតឃើញអាចជាសារធាតុកខ្វក់ដែលមានដើមដំបូងនៅក្នុងវត្ថុធាតុដើមដែលបានប្រើ វត្ថុធាតុដើមទាំងនេះក៏ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើវិធីសាស្ត្រវិភាគ LC-MS ដូចគ្នា។សមា្ភារៈចាប់ផ្តើមដែលបានវិភាគរួមមានទឹក 2% NaHA ក្នុងទឹក 1% NaOH ក្នុងទឹក និង BDDE នៅកំហាប់ដូចគ្នាដែលប្រើក្នុងប្រតិកម្មតំណឆ្លង។អ៊ីយ៉ុងក្រូម៉ាតូក្រាមនៃសម្ភារៈចាប់ផ្តើមដែលប្រើមិនបង្ហាញពីសមាសធាតុ ឬកំពូលណាមួយទេ ហើយពេលវេលារក្សាទុករបស់វាត្រូវគ្នាទៅនឹងកំពូលថ្មីដែលបានសង្កេត។ការពិតនេះបោះបង់គំនិតដែលថាមិនត្រឹមតែសម្ភារៈចាប់ផ្តើមអាចមានសមាសធាតុ ឬសារធាតុដែលអាចរំខានដល់ដំណើរការវិភាគនោះទេ ប៉ុន្តែមិនមានសញ្ញានៃការចម្លងរោគដែលអាចកើតមានជាមួយផលិតផលមន្ទីរពិសោធន៍ផ្សេងទៀតនោះទេ។តម្លៃកំហាប់ដែលទទួលបានបន្ទាប់ពីការវិភាគ LC-MS នៃ BDDE និងកំពូលថ្មីត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងទី 2 (គំរូ 1-4) និងអ៊ីយ៉ុងក្រូម៉ាតូក្រាមក្នុងរូបភាពទី 4 ។
ចំណាំ៖ គំរូ 1-4 ត្រូវគ្នាទៅនឹងវត្ថុធាតុដើមដែលប្រើសម្រាប់ផលិត BDDE cross-linked HA hydrogels ស្វ័យប្រវត្តិ។គំរូទាំងនេះមិនត្រូវបាន autoclaved ទេ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, អាស៊ីត hyaluronic;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន។
រូបភាពទី 4 ត្រូវគ្នាទៅនឹង LC-MS chromatogram នៃគំរូនៃវត្ថុធាតុដើមដែលប្រើក្នុងប្រតិកម្មឆ្លងនៃ HA និង BDDE ។
ចំណាំ៖ ទាំងអស់នេះត្រូវបានវាស់នៅកំហាប់ និងសមាមាត្រដូចគ្នាដែលប្រើដើម្បីអនុវត្តប្រតិកម្មតំណឆ្លង។លេខសម្រាប់វត្ថុធាតុដើមដែលបានវិភាគដោយក្រូម៉ាតូក្រាមត្រូវគ្នាទៅនឹង៖ (1) ទឹក, (2) 2% HA aqueous solution, (3) 1% NaOH aqueous solution ។ការវិភាគ LC-MS ត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់ការបំប្លែងដ៏ធំនៃ 203.30/129.10 Da (ក្នុងរបៀប MRM វិជ្ជមាន)។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, អាស៊ីត hyaluronic;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន។
លក្ខខណ្ឌដែលនាំឱ្យមានការបង្កើតកំពូលថ្មីត្រូវបានសិក្សា។ដើម្បីសិក្សាពីរបៀបដែលលក្ខខណ្ឌប្រតិកម្មដែលប្រើសម្រាប់ផលិតអ៊ីដ្រូហ្សែល HA ដែលភ្ជាប់គ្នាបានប៉ះពាល់ដល់ប្រតិកម្មនៃភ្នាក់ងារភ្ជាប់ BDDE ដែលនាំទៅដល់ការបង្កើតកំពូលថ្មី (ផលិតផលដែលអាចធ្វើទៅបាន) ការវាស់វែងផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានអនុវត្ត។នៅក្នុងការប្តេជ្ញាចិត្តទាំងនេះ យើងបានសិក្សា និងវិភាគទៅលើ BDDE crosslinker ចុងក្រោយ ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយកំហាប់ផ្សេងគ្នានៃ NaOH (0%, 1%, 0.1%, និង 0.01%) នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក aqueous បន្តដោយ ឬគ្មាន autoclaving ។នីតិវិធីបាក់តេរីដើម្បីក្លែងធ្វើលក្ខខណ្ឌដូចគ្នាគឺដូចគ្នានឹងវិធីសាស្ត្រដែលប្រើដើម្បីផលិត HA hydrogel ឆ្លង។ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងផ្នែក "សម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត" ការផ្លាស់ប្តូរដ៏ធំនៃគំរូត្រូវបានវិភាគដោយ LC-MS ទៅ 203.30/129.10 Da ។BDDE និងកំហាប់នៃកំពូលថ្មីត្រូវបានគណនា ហើយលទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងទី 3។ គ្មានចំណុចកំពូលថ្មីត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសំណាកដែលមិនត្រូវបានធ្វើ autoclaved ដោយមិនគិតពីវត្តមានរបស់ NaOH នៅក្នុងដំណោះស្រាយ (គំរូ 1-4, តារាង ៣).សម្រាប់សំណាក autoclaved កំពូលថ្មីត្រូវបានរកឃើញតែនៅក្នុងវត្តមានរបស់ NaOH នៅក្នុងសូលុយស្យុង ហើយការបង្កើតកំពូលហាក់ដូចជាអាស្រ័យលើកំហាប់ NaOH នៅក្នុងដំណោះស្រាយ (គំរូ 5-8 តារាងទី 3) (RRT = 0.79)។រូបភាពទី 5 បង្ហាញឧទាហរណ៍នៃក្រូម៉ាតូក្រាមអ៊ីយ៉ុងដែលបង្ហាញពីគំរូ autoclaved ពីរនៅក្នុងវត្តមានឬអវត្តមាននៃ NAOH ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន។
ចំណាំ៖ ក្រូម៉ាតូក្រាមកំពូល៖ គំរូត្រូវបានព្យាបាលដោយដំណោះស្រាយ aqueous NaOH 0.1% និង autoclaved (120°C សម្រាប់ 20 នាទី)។ក្រូម៉ាតូក្រាមខាងក្រោម៖ គំរូមិនត្រូវបានព្យាបាលដោយ NaOH ទេ ប៉ុន្តែត្រូវបានប្រើប្រាស់ដោយស្វ័យប្រវត្តក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា។ការបំប្លែងដ៏ធំនៃ 203.30/129.10 Da (ក្នុងរបៀប MRM វិជ្ជមាន) ត្រូវបានវិភាគដោយ LC-MS ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន។
នៅក្នុងសំណាក autoclaved ទាំងអស់ ដោយមាន ឬគ្មាន NaOH កំហាប់ BDDE ត្រូវបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំង (រហូតដល់ 16.6 ដង) (គំរូ 5-8 តារាង 2) ។ការថយចុះនៃកំហាប់ BDDE អាចបណ្តាលមកពីការពិតដែលថានៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ទឹកអាចដើរតួជាមូលដ្ឋាន (nucleophile) ដើម្បីបើករង្វង់ epoxide នៃ BDDE ដើម្បីបង្កើតជាសមាសធាតុ 1,2-diol ។គុណភាព monoisotopic នៃសមាសធាតុនេះគឺខុសពី BDDE ដូច្នេះហើយនឹងមិនរងផលប៉ះពាល់ទេ។LC-MS បានរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរដ៏ធំនៃ 203.30/129.10 Da ។
ជាចុងក្រោយ ការពិសោធន៍ទាំងនេះបង្ហាញថា ជំនាន់នៃកំពូលថ្មីអាស្រ័យទៅលើវត្តមានរបស់ BDDE, NAOH និងដំណើរការ autoclaving ប៉ុន្តែមិនមានអ្វីពាក់ព័ន្ធនឹង HA ទេ។
កំពូលថ្មីដែលបានរកឃើញនៅរយៈពេលរក្សាទុកប្រហែល 2.71 នាទីបន្ទាប់មកត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈដោយ LC-MS ។ចំពោះគោលបំណងនេះ BDDE (9.9 mg/mL) ត្រូវបាន incubated នៅក្នុងដំណោះស្រាយ aqueous 1% NaOH និង autoclaved ។នៅក្នុងតារាងទី 4 លក្ខណៈនៃកំពូលថ្មីត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងកំពូលយោង BDDE ដែលគេស្គាល់ (រយៈពេលរក្សាទុកប្រហែល 3.47 នាទី) ។ដោយផ្អែកលើការវិភាគការបែងចែកអ៊ីយ៉ុងនៃកំពូលទាំងពីរ វាអាចសន្និដ្ឋានបានថា កំពូលភ្នំដែលមានរយៈពេលរក្សាទុក 2.72 នាទីបង្ហាញពីបំណែកដូចគ្នាទៅនឹងកំពូលភ្នំ BDDE ប៉ុន្តែមានអាំងតង់ស៊ីតេខុសៗគ្នា (រូបភាពទី 6) ។សម្រាប់កម្រិតកំពូលដែលត្រូវគ្នានឹងពេលវេលារក្សា (PIS) នៃ 2.72 នាទី កម្រិតកំពូលកាន់តែខ្លាំងត្រូវបានគេសង្កេតឃើញបន្ទាប់ពីការបែកខ្ញែកនៅម៉ាស់ 147 ដា។នៅកំហាប់ BDDE (9.9 mg/mL) ដែលប្រើក្នុងការកំណត់នេះ របៀបស្រូបទាញផ្សេងៗគ្នា (UV, λ=200 nm) នៅក្នុងវិសាលគមអ៊ុលត្រាវីយូឡេក៏ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញបន្ទាប់ពីការបំបែកក្រូម៉ាត (រូបភាពទី 7) ។កំពូលជាមួយនឹងពេលវេលារក្សា 2.71 នាទីនៅតែអាចមើលឃើញនៅ 200 nm ខណៈពេលដែលកំពូល BDDE មិនអាចត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង chromatogram ក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា។
តារាងទី 4 លទ្ធផលលក្ខណៈនៃកំពូលថ្មីជាមួយនឹងពេលវេលារក្សាទុកប្រហែល 2.71 នាទី និងកំពូល BDDE ជាមួយនឹងពេលវេលារក្សាទុក 3.47 នាទី
ចំណាំ៖ ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលទាំងនេះ ការវិភាគ LC-MS និង HPLC (MRM និង PIS) ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើកំពូលទាំងពីរ។សម្រាប់ការវិភាគ HPLC ការរកឃើញកាំរស្មីយូវីដែលមានរលកប្រវែង 200 nm ត្រូវបានប្រើ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, chromatography រាវដែលដំណើរការខ្ពស់;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន;m/z សមាមាត្រម៉ាស់ទៅបន្ទុក;PIS ការស្កេនអ៊ីយ៉ុងផលិតផល;ពន្លឺអ៊ុលត្រាវីយូឡេ ពន្លឺអ៊ុលត្រាវីយូឡេ។
ចំណាំ៖ បំណែកដ៏ធំត្រូវបានទទួលដោយការវិភាគ LC-MS (PIS)។ក្រូម៉ាតូក្រាមកំពូល៖ វិសាលគមដ៏ធំនៃបំណែកគំរូស្តង់ដារ BDDE ។ក្រូម៉ាតូក្រាមខាងក្រោម៖ វិសាលគមដ៏ធំនៃកំពូលថ្មីដែលបានរកឃើញ (RRT ដែលទាក់ទងនឹងកំពូល BDDE គឺ 0.79)។BDDE ត្រូវបានដំណើរការក្នុងដំណោះស្រាយ 1% NaOH និង autoclaved ។
អក្សរកាត់: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, chromatography រាវ និង spectrometry ម៉ាស់;MRM, ការត្រួតពិនិត្យប្រតិកម្មច្រើន;PIS, ការស្កេនអ៊ីយ៉ុងផលិតផល;RRT, ពេលវេលារក្សាទុកដែលទាក់ទង។
រូបភាពទី 7 អ៊ីយ៉ុង chromatogram នៃ 203.30 Da precursor ion និង (A) កំពូលថ្មីជាមួយនឹងពេលវេលារក្សាទុក 2.71 នាទី និង (B) ការរកឃើញកាំរស្មី UV នៃកំពូលស្តង់ដារយោង BDDE នៅ 3.46 នាទីនៅ 200 nm ។
នៅក្នុងគ្រប់អ៊ីដ្រូហ្សែល HA ដែលភ្ជាប់ទំនាក់ទំនងគ្នាបានផលិត វាត្រូវបានគេសង្កេតឃើញថាកំហាប់ BDDE សំណល់បន្ទាប់ពីការធ្វើបរិមាណ LC-MS គឺ <2 ppm ប៉ុន្តែកម្រិតខ្ពស់ដែលមិនស្គាល់បានលេចឡើងនៅក្នុងការវិភាគ។កំពូលថ្មីនេះមិនត្រូវគ្នានឹងផលិតផលស្តង់ដារ BDDE ទេ។ផលិតផលស្តង់ដារ BDDE ក៏បានឆ្លងកាត់ការវិភាគគុណភាពដូចគ្នា (ការបំប្លែង MRM 203.30/129.10 Da) នៅក្នុងរបៀប MRM វិជ្ជមាន។ជាទូទៅ វិធីសាស្រ្តវិភាគផ្សេងទៀតដូចជា chromatography ត្រូវបានប្រើជាការធ្វើតេស្តកម្រិតដើម្បីរកឃើញ BDDE នៅក្នុងអ៊ីដ្រូជែល ប៉ុន្តែដែនកំណត់ការរកឃើញអតិបរមា (LOD) គឺទាបជាងបន្តិច 2 ppm ។ម៉្យាងវិញទៀត រហូតមកដល់ពេលនេះ NMR និង MS ត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់លក្ខណៈកម្រិតនៃតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ និង/ឬការកែប្រែ HA នៅក្នុងបំណែកឯកតាស្ករនៃផលិតផល HA ដែលភ្ជាប់គ្នា។គោលបំណងនៃបច្ចេកទេសទាំងនេះមិនដែលមានដើម្បីកំណត់បរិមាណការរកឃើញ BDDE សំណល់នៅកំហាប់ទាបដូចដែលយើងបានពិពណ៌នានៅក្នុងអត្ថបទនេះទេ (LOD នៃវិធីសាស្រ្ត LC-MS របស់យើង = 10 ppb) ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី 01-01-2021